熒光樣本製作所需材料

(一)載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方麵光吸收多，另一方麵不能使激發光在標本上聚集。載玻片要光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用幹涉蓋玻片，這是一種特製的表麵鍍有若幹層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本。

(三)標本

組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，要無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光91好色先生TV和用油鏡觀察標本時，要使用鏡油，請使用特製的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，隻是折光率較低，對圖像質量略有影響。

熒光標本的製作方法：

樣品須經過石蠟包埋切片，然後用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過程：

1. 取材：刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜. 取材時間越快越好.

2. 固定: 組織取下後應立即放入10%福爾馬林(相當於4%甲醛)固定.

注意：(1). 固定液量應為組織塊體積的40倍.

(2) 固定時間：固定時間與使用的固定液種類和組織塊大小, 溫度等有關. 一般為3h-24h.

(3)固定溫度：大多可在室溫固定, 在低溫(4℃)時間應延長.

(4)固定容器：固定容器應大些.

3. 漂洗：流水衝洗2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數分鍾)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→****(60-120’)→****(60-120’).

5. 透明: 組織塊脫水後要經過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑, 而使石蠟進入組織塊. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蠟: 組織經透明後在熔化的石蠟內浸漬的過程稱浸蠟. 一般需經2—3次浸漬才能完成, 總時間為3—4h. 用於浸蠟的石蠟熔點為52—56℃.

7. 包埋: 先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入. 包埋麵要平整. 包埋後石蠟稍凝後可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片：修塊→切片→展片→撈片→烤片.也可作冰凍切片.

熒光染料的配製：

儲藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時須避光，10min左右

用pbs衝去多餘染液即可觀察